A cromatografia é uma técnica de separação física de uma substância de uma mistura . A substância é dissolvida em um meio fluido, a fase móvel , que passa por uma fase estacionária . As diferentes substâncias da fase móvel têm afinidades diferentes para as substâncias que compõem a fase estacionária, de modo que cada substância se move em velocidades diferentes e provoca sua separação do resto das substâncias presentes na mistura.

Existem diferentes tipos de técnicas cromatográficas, por exemplo, cromatografia em camada fina ou cromatografia gasosa. A cromatografia de afinidade é um tipo de cromatografia que separa uma substância de uma mistura por meio de interações moleculares altamente específicas, mas reversíveis , como a interação entre antígenos e anticorpos, enzimas e substratos ou receptores e ligantes, por isso é usada principalmente para separar macromoléculas. biológico 

Descrição geral

Na fase estacionária, é utilizada uma molécula ( ligante ) que possui alta afinidade e seletividade para a substância a ser purificada ( substância alvo ) e que está presente na fase móvel. À medida que a fase móvel avança pela fase estacionária, a substância a ser purificada irá interagir com a fase estacionária, ficando nela aprisionada e separada do resto da mistura.

A fase estacionária é geralmente um sólido, frequentemente gel de agarose, com o ligante de inserção formando o que é conhecido como resina de afinidade . A forma mais comum de realizar cromatografia de afinidade em laboratório é a utilização de colunas cromatográficas , tubos verticais nos quais é introduzida a resina de afinidade e por onde passa a fase móvel.

A substância alvo é retida na resina de afinidade e o resto das substâncias passam e são coletadas no final da coluna. Posteriormente, a coluna é lavada com uma solução tampão que reverte a ligação da substância alvo com o ligante .

Principais etapas da cromatografia de afinidade

Principais usos

A cromatografia de afinidade tem inúmeras aplicações, incluindo purificação de ácido nucleico e purificação de proteína de extratos biológicos. Também é utilizado para a purificação de anticorpos em soros sanguíneos (cromatografia de imunoafinidade), hormônios e enzimas .

Um dos usos mais comuns da cromatografia de afinidade é a purificação de proteínas recombinantes e a cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados , que aproveita a interação de alguns aminoácidos com metais para purificar proteínas, muitas vezes proteínas marcadas com esses aminoácidos por meio de manipulação genética.

Outro tipo muito comum de cromatografia de afinidade é a cromatografia de lecitina . Algumas lecitinas, como a concanavalina A , podem se ligar especificamente a certos carboidratos e essa característica é usada em cromatografia de afinidade para purificar e caracterizar glicoproteínas .